PRACTICA 5: TINCIÓN DE GRAM

TINCIÓN DE GRAM

OBJETIVO
Diferencias las bacterias Gram (+) y Gram (-) en función de las distinta composición de su pared bacteriana. 

MATERIAL 

• Mechero Bunsen
• Portaobjetos
• Asa de platino
• Pipeta Pasteur
• Colorantes de Gram 
• Cristal violeta
• Lugol
• Alcohol-acetona
• Safranina
• Cristalizador, barras paralelas, frasco lavador, microscopio 
• Muestra problema
  
  
  

PRINCIPIO DEL MÉTODO

1. EXTENCIÓN:                                                                                                                     Colocar en un portaobjetos limpio, seco y desengrasado, una gota de solución salina fisiológica estéril utilizando el asa de platino previamente esterilizada.                                                          Tomar asépticamente con el asa una pequeña muestra de cultivo sólido y mezclar con la gota de SSF para obtener una suspensión. Si utilizamos un cultivo líquido, en dicho caso, la muestra se toma con el asa de platino y no es necesario colocar la gota de solución salina.                        Extender la suspensión con el asa de platino previamente esterilizada y enfriada.                     Usamos como microorganismo Estafilococo Aureus.
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3. DESECACIÓN:                                                                                                                           La preparación se deja secar, a temperatura ambiente o calentando muy suavemente, hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse.
   
4. FIJACIÓN:                                                                                                                                   La muestra, una vez extendida y seca, debe fijarse utilizando calor. Esto se consigue pasando el porta, tres veces, por la llama del mechero. Se debe tener cuidado de no calentar mucho el portaobjetos.
5. COLORACIÓN:                                                                                                                            Las extensiones ya fijadas, se sitúan sobre unas paralelas colocadas  en una cubeta y se realiza la tinción.

PROCEDIMIENTO

Colocar las preparaciones sobre una paralelas, en una cubeta y con ayuda de una pipeta Pasteur cubrir toda la superficie de extensón con CRISTAL VIOLETA, que es el colorante primario durante 1 minuto. Trascurrido ese tiempo lavar con agua destilada ligeramente.

Una vez lavado, cubrir con LUGOL durante 1 minuto. Este reactivo actúa como mordiente, que acentúa la penetración del colorante primario. Lavamos con abundante agua.

Decoloración con alcohol-acetona 15-20 segundos. Este reactivo solo arrastra el colorante en las bacterias Gram (-). Esta parte es la mas complicada de la tinción de Gram, ya que si se fuerza el tiempo se pueden obtener resultado erróneos. Lavar con abundante agua, para eliminar todos los restos de alcohol.

A continuación cubrimos el porta con el colorante de contraste SAFRANINA durante 1 minuto y medio. Se puede hacer con Fucsina diluida, pero dejándolo mas tiempo actuar. Esta solución tiñe de rojo las bacterias decolorada, es decir las Gram (-) que tiene una pared celular mas fina.

Lavamos con abundante agua, secamos y ya podemos observarlo al microscopio.

OBSERVACIÓN 

Observamos Gram (-)