PRACTICA 12: PRUEBAS IDENTIFICAITVAS BACILOS GRAM-
PRUEBAS BIOQUIMICAS IDENTIFICATIVAS BACILOS GRAM NEGATIVOS
FUNDAMENTO
Para la identificación de los Bacilos Gram Negativos anaerobios, del tipo de las enterobacterias, se realiza una batería de pruebas bioquímicas con las que se identifican a los que se aíslan mas frecuentemente en nuestro medio.
Estas pruebas son:
LA PRODUCCION DE GAS: En los tubos de Kligler no solo se observa la fermentación de la lactosa y la fructosa, sino también la producción de gas (CO2 y O2) como producto final del metabolismo de los carbohidratos. La producción de gas se pone de manifiesto por la aparición de burbujas, grietas en el medio, desplazamiento del fondo del tubo, etc...
LA PRODUCCION DE ÁCIDO SULFHIDRICO: El ácido sulfhídrico generado con el hierro que contiene el medio ( en forma de sales de hierro) formando sulfuro de hierro (SH2), insoluble u de color negro.
MATERIALES
En primer lugar se expresa si es positivo o no la glucosa, indicando si forma gas. A continuación se expresa la lactosa y en ultimo lugar el SH2. En mi ensayo el resultado es : -, -, -, -
TEST DE LA UREA
FUNDAMENTO
Se utiliza para diferenciar a los microorganismo capaces de hidrolizar la urea por la acción del encima ureasa ( por ejemplo Proteus)
Este enzima al hidrolizar la urea (H2N-CO-NH2) origina amoniaco, el cual produce un incremento del pH del medio que puede detectarse mediante un indicador (rojo fenol)
MATERIALES Y REACTIVOS
FUNDAMENTO
Para la identificación de los Bacilos Gram Negativos anaerobios, del tipo de las enterobacterias, se realiza una batería de pruebas bioquímicas con las que se identifican a los que se aíslan mas frecuentemente en nuestro medio.
Estas pruebas son:
- Kliger
- IMVIC:
- Producción de Indol
- Rojo de metilo
- Voges-Proskauer
- Citrato
- Test de la urea
- Fenil alanina desaminasa
- Reducción de nitrato
- Descarboxilación de lisina, ornitina y arginina (descarboxilasas)
También usamos los sistemas comerciales de identificación, que son muy utilizados:
- Tiras API
- Enterotube
KLIGER
Esta prueba permite identificar a la familia de las enterobacterias. El medio Agar hierro de KLIGER, es un medio sólido diferencial, que se preparar en un tubo inclinado y que contiene lactosa, glucosa, peptonas y un indicador de pH (rojo fenol) que vira a amarillo cuando el pH es ácido, y que toma un color rojo mas intenso ( rojo cereza) cuando el pH pasa a alcalino.
La fermentación o utilización de los hidratos de carbono se produce tanto en condiciones anaerobias como en condiciones aerobias, siguiendo varias rutas metabólicas.
LA FERMENTACION Y UTILIZACION DE GLUCOSA Y LACTOSA
FERMENTACION DE GLUCOSA: Como la concentración de glucosa es baja, su fermentación afecta solo al fondo del tubo, condiciones poco aerobias, que vira a color amarillo. Cuando la glucosa se agota (18-24h.), el microorganismo comienza a utilizar las peptonas del medio, que al liberara amonio, producen un pH alcalino, que hace virar al medio hacia una coloración roja mas intensa en la superficie inclinada del tubo.
FERMENTACION DE GLUCOSA Y DE LACTOSA: Algunos microorganismos pueden fermentar ambos hidratos de carbono y como la concentración de lactosa, en el medio, es diez veces mayor que la concentración de glucosa, no se agota al cabo de 18-24 horas, manteniéndose el pH ácido tanto en el fondo del tubo (amarillo) como en la superficie inclinada ( amarilla)
NO FERMENTACION DE GLUCOSA NI LACTOSA: Algunos bacilos Gram negativos, no pertenecientes a la familia de enterobacterias, no pueden utilizar estos carbohidratos como nutrientes por lo que utilizan las peptonas, presentes en el medio tanto en condiciones aerobias como anaerobias. Cuando las peptonas son degradándose produce un pH alcalino debido a la liberación de aonio y el color del medio cambia a un rojo mas intenso.
Cuando se produce un cambio de color en la superficie inclinada del tubo (reacción alcalina) y no hay cambio de color en el fondo del tubo, nos indica que el microorganismo metaboliza las peptonas únicamente en condiciones aerobias. Por el contrario, cuando el microorganismo es capaz se utilizar la peptonas tanto en condiciones aerobias como anaerobias, se produce la alcalinidad tanto en el superficie inclinada como en el fondo del tubo, ambos de color rojo intenso.
Esta prueba permite identificar a la familia de las enterobacterias. El medio Agar hierro de KLIGER, es un medio sólido diferencial, que se preparar en un tubo inclinado y que contiene lactosa, glucosa, peptonas y un indicador de pH (rojo fenol) que vira a amarillo cuando el pH es ácido, y que toma un color rojo mas intenso ( rojo cereza) cuando el pH pasa a alcalino.
La fermentación o utilización de los hidratos de carbono se produce tanto en condiciones anaerobias como en condiciones aerobias, siguiendo varias rutas metabólicas.
LA FERMENTACION Y UTILIZACION DE GLUCOSA Y LACTOSA
FERMENTACION DE GLUCOSA: Como la concentración de glucosa es baja, su fermentación afecta solo al fondo del tubo, condiciones poco aerobias, que vira a color amarillo. Cuando la glucosa se agota (18-24h.), el microorganismo comienza a utilizar las peptonas del medio, que al liberara amonio, producen un pH alcalino, que hace virar al medio hacia una coloración roja mas intensa en la superficie inclinada del tubo.
FERMENTACION DE GLUCOSA Y DE LACTOSA: Algunos microorganismos pueden fermentar ambos hidratos de carbono y como la concentración de lactosa, en el medio, es diez veces mayor que la concentración de glucosa, no se agota al cabo de 18-24 horas, manteniéndose el pH ácido tanto en el fondo del tubo (amarillo) como en la superficie inclinada ( amarilla)
NO FERMENTACION DE GLUCOSA NI LACTOSA: Algunos bacilos Gram negativos, no pertenecientes a la familia de enterobacterias, no pueden utilizar estos carbohidratos como nutrientes por lo que utilizan las peptonas, presentes en el medio tanto en condiciones aerobias como anaerobias. Cuando las peptonas son degradándose produce un pH alcalino debido a la liberación de aonio y el color del medio cambia a un rojo mas intenso.
Cuando se produce un cambio de color en la superficie inclinada del tubo (reacción alcalina) y no hay cambio de color en el fondo del tubo, nos indica que el microorganismo metaboliza las peptonas únicamente en condiciones aerobias. Por el contrario, cuando el microorganismo es capaz se utilizar la peptonas tanto en condiciones aerobias como anaerobias, se produce la alcalinidad tanto en el superficie inclinada como en el fondo del tubo, ambos de color rojo intenso.
LA PRODUCCION DE GAS: En los tubos de Kligler no solo se observa la fermentación de la lactosa y la fructosa, sino también la producción de gas (CO2 y O2) como producto final del metabolismo de los carbohidratos. La producción de gas se pone de manifiesto por la aparición de burbujas, grietas en el medio, desplazamiento del fondo del tubo, etc...
LA PRODUCCION DE ÁCIDO SULFHIDRICO: El ácido sulfhídrico generado con el hierro que contiene el medio ( en forma de sales de hierro) formando sulfuro de hierro (SH2), insoluble u de color negro.
MATERIALES
- Hilo de siembra estéril
- Medios de cultivo para Kliger
- Estufa y mechero
PROCEDIMIENTO
- En un medio ya preparado de Kliger sembramos una colonia de microorganismo. En nuestro ensayo usamos Pseudomonas, y vamos a verificar que salen las pruebas como deben, para confirmar que son Pseudomonas.
- Sembramos en picadura hasta el fondo del tubo y a continuación se siembra en estría sobre la superficie del pico de flauta, con el mismo hilo de platino.
- Se incuban a 37ºC durante 24 horas.
RESULTADO
En primer lugar se expresa si es positivo o no la glucosa, indicando si forma gas. A continuación se expresa la lactosa y en ultimo lugar el SH2. En mi ensayo el resultado es : -, -, -, -
- Glucosa negativa por no aparece el fondo amarillo
- Lactosa negativa, este microorganismo no utiliza ninguno de estos carbohidratos. Se alimenta de las peptonas del medio tanto en condiciones anaerobias como aerobias. Las peptonas son degradadas en un pH alcalino con liberación de amonio que es lo que provoca el color rojo intenso.
- No produce SH2 porque no aparece ningún precipitado negro.
IMVIC
FUNDAMENTO
Es un conjunto de cuatro pruebas bioquímicas para la identificación bacteriana:
- Indol
- Rojo de metilo
- Voges-Proskauer
- Citrato
MATERIALES UTILIZADOS
- Asa de siembra e hilo estériles
- Estufa y mechero
- Medio de cultivo de caldo de peptona para indol
- Reactivo de Kovacs para el revelado
- Medio de Clark-lubs para rojo de metilo
- Reactivo rojo de metilo
- Medio de cultivo de Clark-lubs para Voges-Proskauer
- Reactivo alfa-naftol y KOH para Voges-Proskauer
- Medio de citrato
PRODUCCION DE INDOL
Se usa para identificar bacterias que producen la enzima triptonasa para degradar triptófano en indol, amonio y ácido. La presencia del indol se visualiza con el reactivo de Kovacs, que provoca la formación de un anillo rojo en el tubo.
El reactivo de Kovacs esta formado por:
- p-dimetilaminobenzaldehido que reacciona con el indo dando un compuesto de color rojo
- CIH que acidifica el medio favoreciendo la reacción
- Alcohol amilico que mantiene el color en la superficie.
PROCEDIMIENTO
Incubamos una colonia de la muestra en el tubo con el medio de cultivo. Lo dejamos en la estufa a 37ºC durante 24 - 48 horas.
Una vez transcurrido ese tiempo le añadimos varias gotas de reactivo de Kovacs, que al ser menos denso que el caldo de peptona queda sobre la superficie de este formando un anillo.
RESULTADO
Si observamos la formación de un anillo de color rojo-morado, la reacción será positiva. Si por el contrario, no observamos diferencia de color en el reactivo de Kovacs, la prueba se considerara negativa.
En nuestro ensayo salió negativo
ROJO DE METILO Y VOGES PROSKAUER
Se usa para identificas a las Enterobacterias, que pueden metabolizar la glucosa en dos fases:
- Metabolismo aerobio (respiración ) consumiendo rápidamente el oxigeno del medio
- Metabolismo anaerobio (fermentación ) que puede ser de dos tipos dependiendo de lso productos finales obtenidos:
ROJO METILO
Fermentación ácido-mixta: Los productos finales son ácidos orgánicos (fórmico, acético, láctico y succínico) y etanol. La liberación de estos ácidos genera un acusado descenso del pH que puede ser detectado añadiendo al medio rojo de metilo.
RESULTADO
Es positiva si se manifiesta un color rojo estable y negativa si aparece un color anaranjado
RESULTADO
Es positiva si se manifiesta un color rojo estable y negativa si aparece un color anaranjado
VOGES PROSKAUER
Fermentación butilen glicólica: Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoina como producto intermedio, que puede ser detectada añadiendo al medio KOH y alfa-naftol que reaccionaran con este compuesto produciendo color rojo característico
PROCEDIMIENTO
Cogemos dos tubos con medio de cultivo liquido de Clark-Lubs e inoculamos las colonias bacterianas. Se incuban a 37ºC durante 24-48 horas.
Una vez transcurrido ese tiempo, añadimos en el primero varias gotas de solución alcohólica de rojo de metilo al 0,04%
En el otro tubo añadimos unas gotas de solución de alfa-naftol, agitamos y añadimos unas gotas de KOH al 40%
Dejamos reposar y leemos transcurridos 15 minutos
RESULTADO
La prueba será positiva si aparece un anillo rojo-fucsia y negativo si se mantiene incolora al añadir KOH y alfa-naftol.
CITRATO
Se usa para identificar enterobacterias.
En esta prueba se determina la presencia de la enzima citrasa que tienen algunos microorganismos para usar el citrato como única fuente de carbono, dando lugar a productos alcalinos.
El citrato se produce típicamente en el ciclo de Krebs, pero algunos organismos son capaces de usarlo como única fuente de carbono, cuando no hay carbohidratos fermentadores en el medio.
PROCESAMIENTO
Usamos un medio de cultivo de citrato de Simmons. Sembramos sobre la superficie del pico de flauta y dejamos incubar a 37ºC durante 24 horas.
RESULTADO
Se considera positiva cuando hay un cambio de color verde al azul.
Una vez transcurrido ese tiempo, añadimos en el primero varias gotas de solución alcohólica de rojo de metilo al 0,04%
En el otro tubo añadimos unas gotas de solución de alfa-naftol, agitamos y añadimos unas gotas de KOH al 40%
Dejamos reposar y leemos transcurridos 15 minutos
RESULTADO
La prueba será positiva si aparece un anillo rojo-fucsia y negativo si se mantiene incolora al añadir KOH y alfa-naftol.
CITRATO
Se usa para identificar enterobacterias.
En esta prueba se determina la presencia de la enzima citrasa que tienen algunos microorganismos para usar el citrato como única fuente de carbono, dando lugar a productos alcalinos.
El citrato se produce típicamente en el ciclo de Krebs, pero algunos organismos son capaces de usarlo como única fuente de carbono, cuando no hay carbohidratos fermentadores en el medio.
PROCESAMIENTO
Usamos un medio de cultivo de citrato de Simmons. Sembramos sobre la superficie del pico de flauta y dejamos incubar a 37ºC durante 24 horas.
RESULTADO
Se considera positiva cuando hay un cambio de color verde al azul.
TEST DE LA UREA
FUNDAMENTO
Se utiliza para diferenciar a los microorganismo capaces de hidrolizar la urea por la acción del encima ureasa ( por ejemplo Proteus)
Este enzima al hidrolizar la urea (H2N-CO-NH2) origina amoniaco, el cual produce un incremento del pH del medio que puede detectarse mediante un indicador (rojo fenol)
MATERIALES Y REACTIVOS
- Agar urea de Christensen en pico de flauta
- Asa de siembra
- Estufa y mechero
PROCEDIMIENTO
Las bacterias se inoculan en el medio a 37ºC durante 24 horas
RESULTADOS
Si el resultado es positivo, indica hidrolisis de la urea, y el medio vira a color rosa
Si el resultado es negativo, en el medio no se observa cambio de color.
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